电针治疗豚鼠卡那霉素中毒性耳聋的实验研究

刘元亮 方剑乔 孙德利 金小明 吴引青 王月芳

浙江中医学院针灸推拿系 (310009)

宋如垓

复旦大学听觉研究室 (200433)

主题词：听力丧失、感觉神经性、针灸疗法、电针疗法、频率跟随反应、针灸、

效应、耳蜗、超微结构、穴位特异性。

近年来，在后天性耳聋中，药物耳毒性副作用已成为首要致聋原因，约占64.7%，其中以氨基甙类抗生素为主要耳毒性药物代表。对药物中毒性耳聋的治疗，目前临床上仍缺乏有效的药物治疗手段。而针灸治聋在我国已有较长的历史，但因难以早期发现给予及时治疗，疗效评定标准不统一，量效关系、穴位配合不确定，实验机理研究很少等问题，不利于开展临床工作及进一步提高疗效。为此，我们采用了听觉电生理学和组织形态学方法，以频率跟随反应(FFR)和听觉脑干诱发电位(ABR)识别判断听阈，以耳蜗铺片术及扫描电镜观察内耳琥珀酸氢酶活性(SDH)及形态学变化为客观指标，在电针疗效的基础上，又对不同波形、不同穴位电针治聋进行了筛选，并探讨了药物中毒性耳聋的早期论断方法及针刺治聋的实验依据及可能机制。

实验方法

1、实验动物模型、分组及治疗

实验用豚鼠来自复旦大学动物房，体重400－ 600g，耳廓反射阳性，以硫酸卡那霉素(上海海普药厂生产，922106，0.5g/2ml)腹腔注射，400mg/kg/d，连续注射10天，停药10天，模型制作成功。

动物随机分为A - I 9个组：A：正常组B:模型组 C：断续波组 D：连续波组 E：密波组 F：疏波组 G：疏密波组 H：翳风、外关、肾俞组 I：听宫、三阴交、筑宾组。

治疗 治疗均于停药且第10天开始，C、D、E、F、G组选用听宫、肾俞、外关；H、I组选用疏密波。以上选穴均根据豚鼠针灸穴位图谱定位。治疗用30号1寸不锈钢针灸针，针刺至一定深度后行平补平泻1分钟，连接G6805──II型电针治疗仪。刺激以耳廓或局部肌肉轻微颤动为度，时间20分钟/次/天，连续治疗20天。

2、FFR和ABR检测

FFR和ABR测量仪由复旦大学生物物理系听觉实验室提供。根据该实验室以前的实验方法，FFR由短纯音信号诱发，选用3680Hz、2560Hz、1280Hz三种频率。ABR由短声诱发，刺激强度由5dB喇叭响度(SPL)衰减可调。

3、耳蜗铺片术：采用显示线粒体琥珀酸脱氢酶的硝基四唑盐(Nitro—BT)染色法(Nachlas法)待耳蜗各回边缘染上一圈深蓝色后，取出耳蜗，浸入福尔马林溶液中固定，然后采用改良耳蜗铺片法，制成耳蜗铺片，光镜观察和摄影。

4、扫描电镜标本制作法：先制成耳蜗整体标本，再用单宁酸处理，磷酸缓冲液充分漂洗，50%、70%、90、100%酒精逐级脱水各20分钟，在4℃下进行。再放入纯醋酸异戊酯浸泡2小时以上，经临界点干燥仪(日立HCP──2)干燥后，用导电胶沾于铜台上，进行真空离子溅射仪(Biko离子溅射仪)喷金镀膜100A。扫描电镜观察摄影。

实验结果

1、不同波形电针对卡那霉素中毒性豚鼠FFR、ABR的影响

注射卡那霉素后第10天豚鼠80dBSPL及阈强度时的FFR各频潜伏期不变，波幅有不同程度的下降，听阈上升，平均增高10～20个dB，以高频阈值增高为著。ABR平均阈为11.08± 3.03dB，较正常豚鼠升高为5.42± 3.03dB。各组FFR、ABR阈值与正常组相比有显著差异(P< 0.01)，但各组之间经齐同分析，差异无显著性(P> 0.05)。表明卡那霉素作用后豚鼠听力损害显著且各组基本一致。

经断续波、连续波、疏密波、疏波和密波电针治疗后，各波形组的FFR、ABR各波潜伏期变化不大，波幅较治疗前有不同程度的增加。FFR听阈下降为10～30dB，ABR听阈下降5～15dB。经统计处理，有显著性或非常显著性意义(P< 0.05或P< 0.01)。

2、不同穴位电针对卡那霉素中毒性耳聋FFR、ABR的影响

注射卡那霉素后豚鼠听力变化基本同前，FFR平均增高15～25个dB，ABR增高平均为5.34± 10.08dB，较正常组差异显著，但各组间无显著性差异。治疗后，各治疗组豚鼠听力均有所恢复，但ABR的阈值变化不明显。各治疗组较模型组，3680Hz、2560Hz高频FFR阈值变化有显著性或非常显著性意义(P< 0.05或0.01)，1280Hz的FFR阈值变化仅I组有意义，其余各组间无显著性差异。说明中毒性聋早期电针治疗能降低高频听阈，或恢复正常，尤以I组听宫、三阴交、筑宾伍用疗效更佳。

4、耳蜗铺片观察 各治疗组毛细胞内有大量深蓝色颗粒，呈弥漫或密集均匀分布，着色较中毒组深，而较正常组稍浅。毛细胞形态完整，排列整齐，偶见散在外毛细胞缺失。模型组外毛细胞着色较差，胞浆内仅有少量蓝色颗粒，稀疏散在分布，且见大量散在的外毛细胞缺失，外毛细胞萎缩不整，内毛细胞染色较深如常，未见明显损伤表现。

5、扫描电镜观察 各治疗组听毛细胞完整，表皮板光滑，纤毛排列整齐，但仍见纤毛分离弯曲倒伏等操作表现。模型组毛细胞纤毛紊乱、分离等损害较严重。纵观整个标本，各治疗组与模型组比较，各治疗组毛细胞损伤程度较轻，听毛排列较模型组整齐，其紊乱、弯曲、变形程度较模型组轻。

讨论

有研究表明，卡那霉素耳毒性作用主要波及外毛细胞，其早期病变为抑制毛细胞内的呼吸酶活性。本实验也观察到三排外毛细胞中以第一排损害最为严重，毛细胞内脱氢反应明显减弱。这与上述结论一致。

ABR是由广频信号短声所诱发，可以反映听觉通路上脑干各核团的功能状态。药物作用后致听力损失，ABR出现变化较FFR变化为迟。因此用ABR监测药物性听力损害难以早期发现。FFR是一种有微音器电位参与而以神经反应成分为主的诱发电位，在一定程度上能反映脑干低位听觉中枢对声刺激反应的频率选择性。宋如垓等研究发现，用FFR可以反映氨基甙类抗生素耳毒作用的病理变化过程，且由于其包含有频率特性比ABR更灵敏，更便于定量分析。其频率变化比ABR出现为早，是一种比较有效的听力学检测指标。本实验FFR与扫描电镜观察联合分析，发现听力损伤轻者，仅见外毛细胞纤毛紊乱、倒伏、粘连或分离，偶见少量散在性纤毛脱落。听力损伤严重者，除见外毛细胞纤毛紊乱等现象外，兼见纤毛大量成批脱落，或毛细胞溶解形成空洞，或毛细胞萎缩，界限不清。损害部位以基底回远段较为严重。当低频听力受到损害或ABR阈值大幅度上升时，第二回外毛细胞可见大量纤毛脱落或紊乱，及外毛细胞萎缩，而内毛细胞很少受损。电针治疗后，FFR阈值下降，毛细胞损伤减轻。

关于针刺治聋机制，本研究观察到，电针治疗后FFR和ABR波幅均有不同程度的增大。表明针刺能改善耳蜗功能以及脑干听觉核团的兴奋性。因此，我们认为针刺一定穴位，改善耳蜗功能及提高脑干听觉核团，大脑皮层听觉中枢的兴奋性是针刺治聋的机制之一。另外，我们也观察到各治疗组外毛细胞内染色较中毒组深，提示毛细胞内琥珀酸脱氢酶活性增加。说明针刺能改善线粒体功能，改善细胞内能量供应，从而使受损的细胞得以恢复，或使得未受损的细胞充分发挥功能。这可能是针刺治聋的又一机制。

本研究结果初步表明，针刺治聋有其电生理学和形态学基础。临床应用以听宫、三阴交、筑宾3穴伍用为佳，对电针波形没有选择性。